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設計 primer 的輔助工具

PCR (Polymerase Chain Reaction, 聚合?鏈反應) 是根據DNA複製的原理, 使特定 DNA 片段大量複製, 由變性 (denature)、黏接 (annealing)、延展(extension) 等反應步驟構成, 使用少量的雙股DNA為模板 (template), 加上單股的引子 (primer)、dNTPs、Taq DNA polymerase、buffers 等, 利用 PCR machine 進行30-40回合 (cycles) 循環的反應程序, 產生特定片段DNA的大量複製。針對 PCR 的原理, 網路上有許多動畫說明可以參考：site 1; site 2; site 3

其中較需要技巧的是 primer 的設計, primer 是一小段與DNA序列互補的nucleotide片段 (通常是取 base sequence 前後一段 20-30 base)，可與變性的（denatured）DNA黏接，提供起始位置，經 DNA polymerase 進行新DNA分子的複製。primer 與 template結合的溫度 (Tm) 通常在 55-61 ℃之間, Tm 太高較不易結合, 太低又會造成隨便結合影響準確性; 此外, primer太長則成本較高, 太短也有隨便結合的缺點, 還有也需要考慮到其它限制? (restriction enzyme) 切位的問題。

一般而言, 常會使用 Oligo calculator 計算其 Tm 值, 另外目前網路上也有許多工具可以提供設計 primer 的服務, 像中研院提供的 PrimerZ, 整合 Ensembl, Primer3, 及 UCSC 資料庫,針對 gene 的 exon 及 promoter 設計primer; 國家衛生研究院開發的 PDA - 線上 primer 設計工具; 另外還可以利用 In-Silico PCR, 經由搜尋資料庫的方式, 預測設計出的 primer 是否會有 PCR 產物。

我們接下來要介紹的是 Primer3 這個工具, 只要將 DNA 片段輸入, 再點選 left & right primer 選項, 然後按下 Pick Primers 即可得到左右兩段 primer。相關操作請參考 Flash 動畫：

ps. 本實作所使用 DNA 片段為 HP0962 (from Helicobacter pylory 26695), 序列如下:

>HP0962
ATGATTGAAGAAAACTACAAAGAAGAGCGTTACACCGAAAGGGTGAATCAAGGCGGTGTA
TGGGGAAGCTTTAAAAGAAAATTTTTGAGTTGGGCTGATGATGATGCGGGCTATGATGAA
GAAAAAGATTATGAAAATCTCTTAAATAATGAAAAGCTCCAAAAAAAATTGCGGGAGTGG
AGGAGAACAAAAAATCAACAAAATAACAACAAAACTTTCAATACGAATGATACGAATTCA
TTTGAAACTATTCAGTCAGTTATTGCTGAGCAATTGAATGTGGATGCGGTGCAAGTTACG
CCAGAGGCGGAATTTGTGAAGGATTTGGGTGCGGACTCTGATGTCGTGGAATTAATCATG
GCACTAGAAGAAAAGTTTGGCATTGAGATTCCTGATGAGCAAGCGGAAAAAATCGTCAAT
GTGGGCGATGTAATGAGATATATTGAGAAACAACTAATTTAA

此外, 也可以利用 Word 或 notepad 土法煉鋼, 設計 primer:

以 pET21-b 為 vector, 限制?為 NdeI- CATATG 及 XhoI- CTCGAG

ATGATTGAAGAAAACTACAAAGAAGAGCGTTACACCGAAAGGGTGAATCAAGGCGGTGTA
TGGGGAAGCTTTAAAAGAAAATTTTTGAGTTGGGCTGATGATGATGCGGGCTATGATGAA
GAAAAAGATTATGAAAATCTCTTAAATAATGAAAAGCTCCAAAAAAAATTGCGGGAGTGG
AGGAGAACAAAAAATCAACAAAATAACAACAAAACTTTCAATACGAATGATACGAATTCA
TTTGAAACTATTCAGTCAGTTATTGCTGAGCAATTGAATGTGGATGCGGTGCAAGTTACG
CCAGAGGCGGAATTTGTGAAGGATTTGGGTGCGGACTCTGATGTCGTGGAATTAATCATG
GCACTAGAAGAAAAGTTTGGCATTGAGATTCCTGATGAGCAAGCGGAAAAAATCGTCAAT
GTGGGCGATGTAATGAGATATATTGAGAAACAACTAATTTAA*

Forward:

5'-CATATGATTGAAGAAAACTACAAAGAAGAG- 3'

將 ATTGAAGAAAACTACAAAGAAGAG
用 Oligo calculator check, 可以得到 Tm 49 ℃, 29 % GC content

Reverse: (記得重排序列及轉換成互補base)

5'-CTCGAGAATTAGTTGTTTTCTCAATATATCTC- 3' (*TAA 為 stop codon, 未加入)

將 AATTAGTTGTTTTCTCAATATATCTC
用 Oligo calculator check, 可以得到 Tm 49 ℃, 23 % GC content

Primer 設計好後, 記得到 NCBI 執行 BLAST 檢查, 避免 genome 上有相同的部份而被切好幾個位置。

 

相關網址連結:

1. Oligo calculator - http://www.pitt.edu/~rsup/OligoCalc.html
2. PrimerZ - http://genepipe.ngc.sinica.edu.tw/primerz/
3. PDA - http://dbb.nhri.org.tw/primer
4. In-Silico PCR - http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
5. Primer3 - http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi